topogen TG2000H-2現(xiàn)貨說(shuō)明書(shū)

人拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα酶–500單位

Human Topoisomerase IIα Enzyme – 500 Units

Human Topoisomerase IIα Enzyme

純化的人拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα（Top2a）過(guò)表達(dá)，并在SDS-PAGE上純化至單一條帶的均一性。拓?fù)洚悩?gòu)酶II高度純化，無(wú)核酸酶污染。

人拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα質(zhì)量控制試驗(yàn)

核酸污染：通過(guò)檢測(cè)線性kDNA和線性質(zhì)粒DNA的形成來(lái)檢測(cè)。在37°C（在top2a測(cè)定條件下，含或不含ATP）下，將1µg連環(huán)KDNA或超螺旋pUC19 DNA孵育4小時(shí)。

通過(guò)在抑制人類(lèi)topo IIa活性的條件下測(cè)定超螺旋DNA的松弛來(lái)評(píng)估與topo I的交叉污染。將過(guò)量純化的酶與pRYG DNA在37°C條件下，在不存在ATP（含或不含Mg++）的情況下孵育2小時(shí)。在這些條件下，不得檢測(cè)到pRYG超螺旋DNA的松弛。

當(dāng)SDS-PAGE凝膠過(guò)載純蛋白時(shí)，可以看到170kDa的主帶。最終餾分中沒(méi)有180kDa拓樸II形式。（不同批次的蛋白質(zhì)濃度不同，但通常在5-50μg/ml的范圍內(nèi)）人類(lèi)拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα的供應(yīng)量為2-10單位/ul（37°C時(shí)，1個(gè)單位將在30分鐘內(nèi)降解0.2μg KDNA）。注意，單位定義基于優(yōu)選的DNA底物kDNA（動(dòng)粒DNA）。我們建議將kDNA底物與這種酶一起使用，因?yàn)橘|(zhì)粒DNA弛豫測(cè)定幾乎不那么敏感。活性基于kDNA脫鏈（而非質(zhì)粒DNA松弛）進(jìn)行驗(yàn)證。

top2酶的最終部分來(lái)自FPLC柱，在以下緩沖液中：10%甘油、50mM Tris（pH 7.7）、1mM EDTA和EGTA、650mM NaCl。

人拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα測(cè)定條件和性能質(zhì)控

使用在拓?fù)銲I反應(yīng)緩沖液（50mM Tris-Cl，pH 8.0，120mM KCl，10mM MgCl2，0.5mM ATP，0.5mM二硫蘇糖醇）中最終體積為20-30µl的動(dòng)載體DNA（KDNA）底物和0.2µg KDNA進(jìn)行鏈連接測(cè)定。用5µl（每20µl反應(yīng)體積）的終止緩沖液（5%沙科西、0.0025%溴酚藍(lán)、25%甘油）終止反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物在含有0.5ug/ml溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠上分析。當(dāng)凝膠運(yùn)行時(shí)，用手持紫外光源可以容易地監(jiān)測(cè)2.5kb DNA微環(huán)脫鏈產(chǎn)物的分辨率。

酶在干冰上運(yùn)輸，應(yīng)在-70°C下儲(chǔ)存。我們還建議在第一次解凍后等分酶（反復(fù)冷凍/解凍會(huì)導(dǎo)致活性喪失）；酶活性穩(wěn)定1-2天（不更長(zhǎng)）。