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worthington磷酸酶

更新時間:2020-03-23      點擊次數:1362

 

worthington磷酸酶

磷酸酶,堿性測定

分析(雞腸酶)

方法:磷酸酶活性的測定是基于Brandenberger和Hanson(1953)和Hofstee(1954)的工作。確定了該酶對鄰羧基苯基磷酸酯的初始水解速率的催化作用。與磷酸酯不同,水楊酸大吸收約300 nm的光。因此水解率可以通過吸光度的增加來確定。在規定的條件下,一個單元在25°C和pH 8.8下每分鐘水解一微摩爾的鄰羧基苯基磷酸酯。

試劑種類

  • 0.1 M Tris·HCl,pH 8.5
  • 0.2 M甘氨酸,pH 8.8
  • 0.05 M氯化鎂
  • 3.65 mM鄰羧基磷酸苯酯(OCPP)

酵素

以1 mg / ml的濃度溶于0.1 M Tris-HCl,pH 8.5(原液)中。活化后可能需要進一步稀釋。

程序

通過在25°C水浴中將mg / ml溶液孵育20-30分鐘來激活酶。

將分光光度計調節至300 nm和25°C。

移液到每個比色皿中,如下所示:

 

0.2 M甘氨酸,pH 8.82.0毫升
3.65毫米OCPP1.0毫升
0.05 M氯化鎂20.5毫升

 

在分光光度計中于25°C孵育3-4分鐘,以達到溫度平衡并確定空白速率(如果有)。加入0.1 ml的原液并記錄從曲線的初始線性部分增加A / 300。

計算方式

計算

分析(大腸桿菌酶)

方法:該方法是Garen和Levinthal(1960)的方法,其中通過測量由對硝基苯基磷酸酯水解為對硝基苯酚而導致的410 nm吸光度的增加來確定反應速度。在規定的條件下,一個單元在25℃,pH 8下每分鐘釋放一微摩爾對硝基苯酚。

試劑種類

  • 1.5 MTris⋅HCl緩沖液,pH 8.0
  • 0.003 M對硝基苯基磷酸酯(PNP)。必須謹慎使用分析級和正確的分子量。

酵素

在試劑級水中稀釋,以獲得0.02-0.04ΔA/分鐘的速率。

方程

程序

將分光光度計調節至410 nm和25°C。

移液到每個比色皿中,如下所示:

 

PNP 0.003百萬1.0毫升
1.5 M Tris·HCl,pH 8.02.0毫升

 

充分混合并在分光光度計中孵育4-5分鐘,以達到溫度平衡并確定空白率(如果有)。加入0.1毫升稀釋的酶并記錄。從曲線的線性部分確定3-5分鐘的A 410。

計算方式

計算

分析(小腸酶)

方法:在37°C,pH 9.8下,每分鐘可水解1 umole的對硝基苯酚磷酸酯。

試劑種類

  • 1.0 M二乙醇胺和0.05 mM MgCl 2緩沖液,pH 9.8:用試劑級水稀釋12.4 gm二乙醇胺(85%)。加入0.05 ml MgCl 2溶液(見下文),并用HCl將pH調節至9.8(在37°C下)。用試劑級的水調節至100 ml。
  • MgCl 2溶液:將20.3 g MgCl2°6 H2O溶于100 ml試劑級的水中。
  • 0.67 M磷酸對硝基苯酯溶液:將250 mg磷酸對硝基苯酯鈉鹽溶于1.0 ml試劑級的水中。
  • 稀釋劑:0.1 M TEA·HCl。將1.86克TEA·HCl溶于試劑級的水中,添加0.1毫升MgCl 2溶液和0.1毫升0.1 M ZnCl 2,用NaOH調節pH到7.6,然后用試劑級的水調節到100毫升。

酵素

使用稀釋劑獲得大約0.05-0.06 u / ml。在室溫下靜置15-20分鐘。

程序

將分光光度計調節至405 nm和37°C。

移液到試管中:

 

 測試空白
緩沖3.00毫升3.00毫升
磷酸4-硝基苯酯0.050毫升0.050毫升
混合并保溫以達到溫度平衡。
沖淡------0.050毫升
樣品0.050毫升------

 

混合。測量吸光度的變化,并根據曲線的線性范圍計算ΔA/ min。

計算方式

計算

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